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Le séquençage du SDRPv et son utilisation pratique

Il est très important d'analyser les nouvelles séquences de virus du SDRP par rapport à un large ensemble de référence représentatif de l'élevage, du système et de la région, ainsi qu'aux séquences des vaccins disponibles sur le marché (ceci permettra de différencier les souches de terrain et vaccinales).

Le syndrome dysgénésique et respiratoire porcin (SDRP) reste, de loin, la maladie ayant le plus grand impact économique dans l'industrie porcine et son contrôle est loin d'être satisfaisant. Une image meilleure et plus complète de la variation du virus du SDRP et le suivi de la circulation de nouvelles souches dans une zone / un pays / un continent donné aiderait certainement les vétérinaires et les producteurs à mettre en place des programmes de contrôle et éventuellement d'éradication. Pour cette raison, à partir de la fin des années 90, le séquençage du virus du SDRP a commencé à être disponible dans le monde entier, principalement en Amérique du Nord, en Europe et en Asie du Sud-Est.

Le génome du virus SDRP (image 1) est constitué d'une molécule d'ARN monocaténaire qui le rend vulnérable aux "erreurs" (mutations génétiques) au cours de sa réplication chez l'hôte. Cette «tendance à faire des erreurs» entraîne la présence sur le terrain de différentes souches de virus du SDRP, toutes uniques dans leur propre séquence génétique. Il existe toujours un débat entre les vétérinaires de terrain et les chercheurs sur la question de savoir si ces différences dans les séquences contribuent à des «comportements différents» (qu'ils soient cliniques-pathologiques ou immunologiques).

Figure 1. Le génome du virus SDRP est une molécule d'ARN monocaténaire.

Figure 1. Le génome du virus SDRP est une molécule d'ARN monocaténaire.

Concepts de base du séquençage du SDRP

Le séquençage du virus est réalisé à partir de produits PCR issus d'échantillons de terrain (sérums, tissus, fluides oraux) en obtenant la lecture de nucléotides généralement à partir de certains fragments du génome de l'ARN viral (voir figure 2) dans certaines régions cibles - ORF (Open Reading Frame), puis on compare le pourcentage d'homologie grâce à l'analyse phylogénétique effectuée à l'aide de logiciels spécifiques. Le résultat de ce processus fournit le degré de similitude (homologie) entre les différentes souches de virus SDRP. En utilisant un logiciel de visualisation graphique, on peut également obtenir un dendrogramme (ou «arbre phylogénétique») qui montre le degré de relation avec la séquence virale de référence (voir figure 3).

Figure 2. Le séquençage du virus est réalisé à partir de produits de PCR en obtenant la lecture de nucléotides généralement à partir de certains fragments du génome de l'ARN viral dans certaines régions ORF cibles.

Figure 2. Le séquençage du virus est réalisé à partir de produits de PCR en obtenant la lecture de nucléotides généralement à partir de certains fragments du génome de l'ARN viral dans certaines régions ORF cibles.

Figure 3. Les dendrogrammes ou «arbre phylogénétique» sont utilisés pour représenter graphiquement le degré de similitude (homologie) entre différents virus du SDRP avec une séquence virale de référence.

Figure 3. Les dendrogrammes ou «arbre phylogénétique» sont utilisés pour représenter graphiquement le degré de similitude (homologie) entre différents virus du SDRP avec une séquence virale de référence.

Le génome du SDRPv code au moins 10 ORF. Les plus couramment utilisés pour le séquençage, bien qu'ils ne représentent que 4% et 3% respectivement du génome complet, sont ORF5 (codant pour la protéine E non glycosylée ) et ORF7 (codant pour la protéine de nucléocapside (N)). ORF5 représente une région plus variable, alors que ORF7 représente une région plus conservée. À cause de cela, le même degré de variation (par exemple une variation de 5%) rencontrée en 7 est « dramatique » en termes de changement génétique, par rapport à la même variation en ORF5. L'interprétation des similitudes (c.-à-d. Si les virus sont apparentés ou non) nécessite beaucoup plus d'informations supplémentaires, puisque le taux de changement génétique peut être très variable.

Il est extrêmement important de garder un fichier d'enregistrement de toutes les séquences identifiées de façon univoque, en notant soigneusement la date, le type d'élevage(site 1-2-3), le flux de porcs, l'emplacement (latitude / longitude GPS) et l'origine de la séquence (type d'animal / tissu / échantillon). Aujourd'hui, notre base de données des séquences de virus SDRP couvre plus de 1300 séquences ORF7 depuis 2002. Pour interpréter et comprendre les différences, il est encore plus important de faire le lien entre les séquences individuelles et des événements cliniques tels que le nombre de truies ayant avorté et la mortalité avant sevrage dans les sites 1 ou le taux de mortalité dans les sites 2 et 3.

Questions pratiques

Les questions fréquentes des producteurs et des vétérinaires sont:

  • Les différences génétiques observées entre les séquences représentent-elles la variation normale d'une seule souche de SDRP dans un élevage/ un système, ou représentent-elles plusieurs souches différentes présentes en même temps, ou dans un court espace temporel, dans un élevage / un système?
  • S'agit-il d'une «nouvelle épidémie» causée par une «nouvelle souche» ou est-ce une recirculation?

Pour répondre à ces questions, nous devons nous mettre d'accord sur le degré d'homologie accepté de deux souches virales recueillies dans un certain laps de temps (12-24 mois?). En d'autres termes, le cut-off (seuil) de similitude. Une homologie de 97-98% dans la séquence (ou une différence de 2-3%) est une valeur généralement acceptée. Selon mon expérience, c'est assez difficile de voir un changement supérieur à 2% dans une «population fermée cliniquement stable» (une population conventionnelle de truies ou un flux de porcs) car nous observons que nous obtenons « la même souche » pendant une période jusqu'à 3 ans dans une population unique cliniquement stable. A l'inverse, chaque fois que nous remarquons une activité constante du SDRP, une souche «nouvelle» et phylogénétiquement différente est récupérée (90% d'homologie ou moins). Malheureusement, nous ne savons pas avec certitude si ces grandes différences que nous observons parfois sont le résultat d'un changement soudain du virus / mutation (improbable selon mon opinion personnelle) ou de l'introduction d'une nouvelle souche. Ce qui est clair et bien accepté est le fait que la similitude / diversité génétique n'est en aucun cas prédictive de la similitude immunologique (c'est à dire indicative d'une immunité protectrice croisée) et n'est absolument pas prédictive de la pathogénicité intrinsèque absolue (elle ne dit pas si une souche particulière est "bonne" ou "mauvaise").

Les séquences complètes du génome qui sont actuellement disponibles (malheureusement encore plus à des fins de recherche que pour un usage diagnostique quotidien) aideront certainement à répondre à cette question.

Il est très important d'analyser les nouvelles séquences de virus du SDRP par rapport à un large ensemble de référence représentatif de l'élevage, du système et de la région, ainsi qu'aux séquences des vaccins commerciaux disponibles (cela permettra de différencier les souches de terrain et vaccinales). Actuellement, nous utilisons encore un logiciel open source géré par l'Université de Padoue pour construire nos arbres phylogénétiques et les organiser par flux de porcs dans l'ensemble de notre système de production; dans un proche avenir, nous pourrions nous joindre à deux autres programmes informatiques "ad hoc" (Bioportal de l'Université de Davis-California et CLASSIFARM-PATH de IZSLER (Brescia, Italie) qui auront un ensemble beaucoup plus grand de séquences à comparer et pour permettre une meilleure compréhension du virus du SDRP circulant en Italie et éventuellement dans l'UE.

Remerciements: Merci au Prof. Michele Drigo (UNI-PD) pour la discussion intéressante et la révision de ce document.

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