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Le test ELISA comme outil de diagnostic (1/2) : principes de base

Dans cet article, nous expliquons comment fonctionnent les tests ELISA, ce qu'ils détectent et comment interpréter les résultats.

L'utilisation du test immuno-enzymatique (ELISA de l'anglais enzyme-linked immunosorbent assay) pour la détection de protéines (antigènes ou anticorps) est l'un des outils les plus facilement disponibles dans le monde et est actuellement largement utilisé en production porcine. Ce test est couramment utilisé pour la surveillance et le suivi des maladies, ainsi que comme outil de diagnostic. Comme il est souvent utilisé par les vétérinaires porcins, il est essentiel de comprendre comment il fonctionne, ce qu'il détecte et ses avantages ou inconvénients lors de l'interprétation des résultats. Il est également important de se rappeler que même si la même technologie est utilisée pour différents agents pathogènes, les résultats doivent être interprétés de manière différente.

Information sur le test

Les tests ELISA sont conçus pour la détection d'antigènes ou d'anticorps pour des bactéries ou des virus. Les antigènes sont des protéines étrangères à l'organisme qui stimulent la production d'anticorps (antigène signifie générateur d'anticorps en anglais - antigen generator). Lorsque l'on pense aux anticorps, il faut garder à l'esprit qu'ils sont toujours dirigés contre des protéines. Lors de la conception du test, le fabricant, ou le laboratoire, décide de la ou des protéines spécifiques qui seront ciblées. Si le test ELISA cible directement une protéine de la bactérie ou du virus, il s'agit d'un test ELISA antigène, tandis que si la cible est la réponse en anticorps de l'animal à la bactérie ou au virus, il s'agit d'un test ELISA anticorps. Bien qu'il existe des tests ELISA conçus pour cibler une ou deux protéines seulement (anticorps ou antigènes), de nombreux tests ELISA ciblent un grand nombre de protéines. Les tests peuvent également être conçus pour détecter un type spécifique de réponse anticorps (IgG, IgM ou IgA) ou une combinaison de ceux-ci. Chacun de ces types d'anticorps a des fonctions spécifiques qui dépassent le cadre de cet article.

Le concept et le processus de détection des anticorps ou des antigènes par ELISA sont exactement les mêmes. Cela commence par l'obtention de la protéine cible (antigène ou anticorps). Pour les protéines individuelles, un processus distinct est nécessaire pour obtenir une concentration purifiée de cette protéine particulière. Identifier la ou les protéines à cibler est un processus complexe et scientifique. Idéalement, le test cible une seule protéine qui est unique à l'agent pathogène d'intérêt (ne réagit pas de manière croisée avec d'autres agents pathogènes), hautement immunogène (pour la détection d'anticorps) ou présente en fortes concentrations (pour la détection d'antigènes) ; il cible une protéine dont on sait qu'elle est fortement corrélée à la protection contre la maladie et qui sera toujours présente. Malheureusement, la plupart de ces critères sont inconnus et on utilise soit une seule protéine, qui peut être produite et facilement trouvée dans l'échantillon, soit un mélange de plusieurs protéines (virus ou bactéries entières). Bien que l'utilisation de virus ou de bactéries entières puisse être facile, ils sont plus susceptibles de réagir de manière croisée avec d'autres agents pathogènes.

Étapes générales du processus (ver figura 1).

  • Etape 1 : les micropuits sont recouverts avec le ou les antigènes cibles (pour détecter les anticorps) ou les anticorps (pour détecter les antigènes).

  • Étape 2 : on ajoute les échantillons à tester et on les incube pour permettre la liaison entre les antigènes et les anticorps.

  • Étape 3 : on retire l'échantillon et on ajoute les anticorps spéciaux qui se lieront au côté opposé des anticorps (partie inférieure du "Y" de l'anticorps dans la détection des anticorps) ou des antigènes (partie supérieure du "Y" dans la détection des antigènes). L'échantillon est ensuite incubé pour permettre la liaison et lavé pour s'assurer que les anticorps ou antigènes non liés (c'est-à-dire les non cibles) sont éliminés.

  • Étape 4 : on ajoute un anticorps marqué avec un détecteur qui émet une fluorescence et se lie aux anticorps spéciaux de l'étape 3 (ils se fixent à la partie inférieure du " Y " de l'anticorps ; il s'agit de la même cible pour la détection des antigènes et des anticorps). L'échantillon est ensuite réincubé pour permettre la liaison et lavé à nouveau pour s'assurer que les anticorps marqués non liés sont éliminés

  • Étape 5 : le réactif qui déclenchera la fluorescence des anticorps marqués qui se sont fixés est ajouté, puis incubé pour assurer la liaison.

  • Étape 6 : l'échantillon est lu, généralement à l'aide d'une machine spéciale calibrée à une longueur d'onde spécifique pour quantifier le changement de couleur (appelé absorbance). Il existe de légères variations dans ce processus selon qu'il s'agit d'un test ELISA direct, indirect ou sandwich ; chaque type a ses avantages et ses inconvénients (que nous n'aborderons pas ici) mais, au final, tous donnent les mêmes résultats : plus l'absorbance, ou le changement de couleur, est élevée, plus la concentration attendue de l'antigène ou de l'anticorps cible dans l'échantillon testé est importante.

Figure 1 : Vue d'ensemble du test de diagnostic basé sur le test immuno-enzymatique (ELISA). Le test ELISA peut être présenté sous différents formats en fonction des différences d'immobilisation des antigènes et de marquage des anticorps. Dans le test ELISA direct, les antigènes du virus liés à une phase solide en plastique sont détectés par l'ajout d'un anticorps conjugué. Dans le test ELISA sandwich, l'anticorps de capture se lie à la phase solide en plastique. Les antigènes de l'échantillon se lient à l'anticorps de capture et sont ensuite détectés par un second anticorps marqué par une enzyme. Dans le test ELISA compétition, l'antigène viral de l'échantillon est pré-incubé avec l'anticorps primaire, puis ajouté à un puits recouvert d'un anticorps secondaire avec un antigène conjugué à une enzyme qui entre en compétition avec l'antigène de l'échantillon pour se lier à l'anticorps primaire. Plus l'antigène viral est présent dans l'échantillon, moins l'antigène conjugué se fixera et plus le signal sera faible. Source : Adapté de Ghaffari et al. 2020.

Figure 1 : Vue d'ensemble du test de diagnostic basé sur le test immuno-enzymatique (ELISA). Le test ELISA peut être présenté sous différents formats en fonction des différences d'immobilisation des antigènes et de marquage des anticorps. Dans le test ELISA direct, les antigènes du virus liés à une phase solide en plastique sont détectés par l'ajout d'un anticorps conjugué. Dans le test ELISA sandwich, l'anticorps de capture se lie à la phase solide en plastique. Les antigènes de l'échantillon se lient à l'anticorps de capture et sont ensuite détectés par un second anticorps marqué par une enzyme. Dans le test ELISA compétition, l'antigène viral de l'échantillon est pré-incubé avec l'anticorps primaire, puis ajouté à un puits recouvert d'un anticorps secondaire avec un antigène conjugué à une enzyme qui entre en compétition avec l'antigène de l'échantillon pour se lier à l'anticorps primaire. Plus l'antigène viral est présent dans l'échantillon, moins l'antigène conjugué se fixera et plus le signal sera faible. Source : Adapté de Ghaffari et al. 2020.

Figure 2A. ELISA : Calcul du taux d'antigène ou d'anticorps basé sur l'absorption.

Figure 2A. ELISA : Calcul du taux d'antigène ou d'anticorps basé sur l'absorption.

Dans le cas d'un ELISA compétition, le point essentiel est que le processus utilisé produira en fait le résultat opposé (voir figure 2B). L'échantillon et une quantité connue d'antigène (pour la détection d'antigènes) ou d'anticorps (pour la détection d'anticorps) marqués sont ajoutés à l'échantillon à tester de sorte que, une fois ajoutés aux puits marqués, l'échantillon original et les protéines marquées ajoutées (anticorps ou antigènes) entrent en compétition pour se lier au puits préalablement recouvert. En bref, s'il n'y a pas de protéines cibles dans l'échantillon à analyser, toutes les protéines marquées pourront se lier au puits, générant un fort changement de couleur. D'autre part, si l'échantillon contient un nombre considérable de protéines cibles, celles-ci vont concurrencer (bloquer) la liaison des protéines marquées. Lorsque l'échantillon est lavé, toutes les protéines marquées qui n'ont pas pu se lier sont éliminées. Par conséquent, plus il y a d'anticorps ou d'antigènes dans l'échantillon, plus ils empêchent les protéines marquées de se fixer et sont éliminés lors du lavage. Cela implique une faible absorbance lorsque la concentration de la protéine cible dans l'échantillon est élevée, ce qui est l'inverse du cas précédent. Des valeurs élevées suggèrent une faible concentration ou un échantillon négatif et rendent impossible la quantification de la concentration en antigènes/anticorps des échantillons positifs.

Figure 2B. ELISA compétition. Calcul du taux d'antigène ou d'anticorps en fonction de l'absorbance.

Figure 2B. ELISA compétition. Calcul du taux d'antigène ou d'anticorps en fonction de l'absorbance.

Le cut-off de chaque test ELISA peut être différent et est prédéfini par le fabricant en fonction de la sensibilité et de la spécificité souhaitées. Pour les tests ELISA directs, indirects ou sandwich, tout nombre supérieur au cut-off est considéré comme positif. Pour un ELISA compétition, tout nombre supérieur au cut-off est considéré comme négatif. Pour certains tests, une zone grise est établie pour classer les échantillons comme "suspects", car le test a tendance à avoir des réactions "de fond" (réactions croisées) qui rendent difficile l'établissement d'un cut-off clair.

Les résultats sont généralement, mais pas toujours, présentés sous la forme d'un S:P corrigé ou d'un pourcentage de positivité par rapport au témoin positif corrigé selon le changement de couleur de fond des puits de contrôle négatif. Les niveaux d'anticorps sont souvent appelés "titres". Bien que ce ne soit pas techniquement correct, cela peut être justifié d'un point de vue général. Un point essentiel est que lorsqu'on parle de titres, il existe une relation mathématique directe entre les valeurs (une valeur de 20 contient deux fois plus d'anticorps qu'un échantillon de valeur 10). Avec les valeurs ELISA, cette relation mathématique directe n'existe pas (voir figure 2A). Un titre ELISA de 2,0 contient beaucoup plus d'anticorps qu'un titre ELISA de 1,0 et pas seulement deux fois plus.

Regroupement d'échantillons pour l'analyse (pooling)

Comme les tests ELISA dépendent de la concentration (ils sont directement corrélés à la concentration de la protéine cible [anticorps ou antigène]), il est fortement déconseillé de regrouper les échantillons. Le pooling peut augmenter considérablement la probabilité de manquer un échantillon positif.

Quelques utilisations de l'ELISA:

  • Détecter la présence d'anticorps contre des agents pathogènes spécifiques - ELISA anticorps - Utilisation la plus courante.
  • Déterminer l'exposition à un agent pathogène.
  • Déterminer le statut vaccinal d'un animal.
  • Déterminer le moment de l'infection (changement du taux d'anticorps) dans le temps.
  • Détecter la présence d'un pathogène cible par la détection de protéines/antigènes du pathogène cible - ELISA antigènes.

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