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Le test PCR comme outil de diagnostic (1/2) : Principes de base

Nous expliquons comment fonctionne la PCR et à quoi il faut faire attention lors de l'interprétation des résultats.

La réaction en chaîne par polymérase (polymerase chain reaction ou PCR) est l'un des outils de diagnostic les plus couramment utilisés par les vétérinaires spécialisés en production porcine. Elle est utilisée non seulement à des fins de diagnostic, mais aussi pour améliorer la biosécurité par la surveillance et le contrôle des maladies. Il est donc essentiel de comprendre les avantages et les inconvénients de cette technologie lors de l'interprétation des résultats. Il est également important de se rappeler que même si la même technologie est utilisée pour différents agents pathogènes, il devrait y avoir des différences dans l'interprétation de ces résultats.

Informations sur le test

La PCR est conçue pour la détection du matériel génétique (ADN ou ARN) des bactéries ou des virus. Le processus commence par l'extraction de l'ADN ou de l'ARN de l'échantillon, qui est ensuite soumis à des cycles d'amplification thermique. Si le matériel extrait est de l'ARN, la première étape consiste à convertir l'ARN en ADN (techniquement connu sous le nom d'ADN complémentaire ou ADNc). Le cycle thermique consiste en un processus en 3 étapes : 1) dénaturation, 2) alignement et 3) extension, aboutissant à la duplication de l'ADN présent dans l'échantillon. Par conséquent, pour chaque cycle (1 Ct), en supposant une efficacité de 100 %, on obtient le double de la quantité d'ADN présente. L'objectif est de poursuivre le processus d'amplification jusqu'à ce qu'une quantité suffisante d'ADN soit détectée pour que l'échantillon soit positif ou jusqu'à 30-40 cycles, en fonction de la conception du test utilisé.

Schéma du mécanisme de la PCR.

Schéma du mécanisme de la PCR.

Le processus d'extraction est une étape critique du test PCR, car il affecte la quantité et la qualité du matériel génétique de l'échantillon testé. Il est essentiel d'utiliser le processus d'extraction approprié pour le type d'échantillon testé (sérum, fluides oraux, tissus, etc.). L'étape 2 du processus d'amplification (alignement) nécessite l'utilisation d'amorces, qui sont de courts morceaux de séquences d'ADN spécifiquement conçus pour se lier à la séquence génétique spécifique de l'agent pathogène en question et aider à la répliquer. Pour les agents pathogènes qui évoluent constamment sur le plan génétique (comme le virus du SDRP), ces amorces doivent être mises à jour périodiquement afin de garantir que de nouvelles souches continuent d'être détectées.

Le nombre seuil de cycles de test (généralement autour de 30-40) est fixé en déterminant que si le processus d'amplification devait se poursuivre, le test serait finalement positif en raison de l'alignement et de l'extension spontanés. Cela suggère que les résultats faiblement positifs, avec des valeurs Ct élevées proches du seuil, nécessitent une attention particulière lors de l'interprétation des résultats, notamment à la fin d'une épidémie.

Il existe deux utilisations différentes des tests PCR en médecine vétérinaire porcine. La traditionnelle PCR en gel et la plus moderne PCR en temps réel. Les deux tests fonctionnent de la même manière, en se basant sur l'amplification de l'ADN ou de l'ARN. La différence est que la PCR en gel n'est "lue" qu'une seule fois à la fin du test, alors que dans la PCR en temps réel, les résultats du test sont "lus" après chaque cycle. L'avantage de la PCR en temps réel est qu'elle permet d'obtenir des résultats quantitatifs/semiquantitatifs.

Regroupement des échantillons pour l'analyse

Les tests PCR ont une grande capacité à détecter de petites quantités de matériel génétique dans les échantillons (sensibilité analytique) grâce au processus d'amplification, ce qui offre la possibilité d'analyser plusieurs échantillons avec un seul test (regroupement). Il est important de se rappeler que le regroupement va, par définition, diluer l'échantillon analysé. Cela ne devrait pas poser de problème lorsque la concentration attendue d'un agent pathogène donné est élevée (notamment au début d'une épidémie). Toutefois, le regroupement peut poser un problème lorsque la concentration de l'agent pathogène dans un échantillon positif est faible, par exemple à la fin d'une épidémie ou dans un type d'échantillon dont on s'attend déjà à ce qu'il soit dilué (fluides oraux).

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